Estudio biofísico y enzimológico de las reacciones fotorreducción de compuestos oxidados de nitrógeno (Nitrato y Nitrito) NADP y glutatión en cianobacterias

La vida en nuestro planeta depende admirablemente y de f orma casi absoluta de la energía radiante de la luz solar, la cual llega incesantemente a la biosfera en cantidades enormes (1017 W = 3 * 1024 J por año). La energía luminosa es convertida en otras formas de energía mediante la función clorofílica ó Fotosíntesis que llevan a cabo los organismos fotoergónicos (algas verdeazuladas ó cianobacterias, algas verdes y plantas superiores). Este proceso consiste esencialmente en la transformación –mediante la clorofila a de los centros de reacción del aparato fotosintético- de la energía electromagnética en energía electrónica y subsiguientemente en energía redox. La reacción primordial de la Fotosíntesis es la lisis ó rotura del agua, a expensas de la energía de la luz, en poder reductor –electrones al nivel del electrodo de hidrógeno- y oxígeno molecular. De esta forma, el flujo de fotones que excita a los pigmentos fotosintéticos es convertido en un flujo de electrones canalizado a través de los transportadores redox apropiados. El transporte de electrones fotosintético que resulta de la deshidrogenación del agua se encuentra acoplado con la formación de energía química de enlace fosfato, es decir, con la transformación del fosfato inorgánico (Pi) en fosfato orgánico rico en energía (~ P)(7,8). El resultado global de estos procesos es el desprendimiento de O2 y la generación del poder asimilatorio necesario para convertir los nutrientes inorgánicos como el anhídrido carbónico, nitrato, sulfato y fosfato –los cuales se encuentran totalmente oxidados- en las complejas macromoléculas (carbohidratos, proteínas, ácidos nucleicos, etc.) que constituyen el material celular. A este respecto, es interesante señalar que probablemente el oxígeno producido en la Fotosíntesis por organismos similares a las cianobacterias actuales, generó hace unos dos mil millones de años –a mediados del Precámbrico- una atmósfera oxidante similar a la actual. La importancia de las cianobacterias respecto de la bioenergética de la Fotosíntesis, radica en que constituyen los únicos organismos procarióticos capaces de realizar una Fotosíntesis oxigénica (con desprendimiento de oxígeno), similar a la presentada por los cloroplastos de algas verdes y plantas. 1. El nitrato y el nitrito se comportan en cianobacterias como activos agentes amortiguadores de la fluorescencia de la clorofila a “in vivo” pero mientras que el nitrito ejerce por sí mismo un claro efecto amortiguador de la fluorescencia, la visualización del efecto del nitrato exige un tratamiento previo (sonicación suave, bajas concentraciones de detergente) que altere la permeabilidad celular. 2. El efecto amortiguador del nitrato y del nitrito necesita para manifestarse un flujo de electrones funcional y la presencia de los enzimas del sistema de reducción asimilatoria del nitrato. Por otra parte, ninguno de estos compuestos afectó significativamente a la fluorescencia de las ficobilinas. 3. los estudios sobre la fluorescencia de la clorofila a de células de cianobacterias, han confirmado por tanto de una forma clara y directa la naturaleza fotosintética “in vivo” de la reducción asimilatoria del nitrato y del nitrito, los cuales actuarían como reactivos de Hill directos y fisiológicos en estos microorganismos. 4. La ferredoxina-NADP+ oxido-reductasa, el enzima que cataliza la reducción fotosintética del NADP+, se ha purificado de una cianobacteria hasta homogeneidad electroforética empleando un nuevo método, más rápido y eficaz que los anteriormente descritos para este enzima, basado en la utilización de la cromatografía de afinidad en 2’,5’-ADP-Sefarosa 4B. 5.el enzima se ha caracterizado, resultando se bastante similar al de cloplastos; sin embargo, un peso molecular ligeramente menor y un carácter ácido más acentuado parecen ser característicos para el enzima de cianobacterias en comparación con el de plantas superiores. 6. el estudio de las propiedades redox del grupo prostético flavínico FAD de la ferredoxina-NADP+ oxido-reductasa, ha permitido establecer la importancia de las formas semiquinona azul e hidroquinona del grupo prostético en el mecanismo de las reacciones dependientes de la ferredoxina y de la actividad diaforasa, respectivamente. 7. Se ha mostrado de una forma clara el origen proteolítico de la aparición de múltiples formas moleculares de la ferredoxina-NADP+ oxido-reductasa de Anabaena sp. 7119. 8. El proceso de interconversión redox mediado por el par NADPH/NADP+ es una característica intrínseca de la ferredoxina-NADP+ oxido-reductasa purificada de Anabaena sp. 7119. 9. Aunque la interconversión redox implica reducción y oxidación del grupo prostético del enzima, paree existir una relación directa entre este proceso y el establecimiento, a partir de la forma de semiquinona azul del FAD de la ferredoxina-NADP+ oxido-reductasa, de un complejo de transferencia de cargas {FADH2 NADP+}, en el que el piridín nucleótido estaría unido a la proteína de forma anómala. 10. El hecho de que únicamente aquellas actividades de la ferredoxina-NADP+ oxido-reductasa que utilizan el NADPH –pero no aquellas que emplean el NADP+ como sustrato- sean inhibidas por reducción, puede tener un claro significado fisiológico, en el sentido de evitar, en las condiciones reductoras en las que el enzima se encuentra “in vivo”, un derroche del poder reductor asimilable. 11. La inactivación total e irreversible de la ferredoxina-NADP+ oxido-reductasa de Anabaena sp. 7119, producida en ausencia de aceptores por el NADPH a valores de pH superiores a 9 ó en presencia de reactivos de grupos sulfhidrilo, es debida a la separación del apoenzima y consiguiente pérdida del cofactor flavínico FAD. 12. Se ha caracterizado por primera vez la actividad glutatión reductasa de cianobacterias. La actividad está presente en la fracción soluble tanto de células vegetativas como heterocistos de Anabaena sp. 7119. 13. La glutatión reductasa se ha purificado hasta homogeneidad de Anabaena sp. 7119 empleando un nuevo procedimiento muy eficiente. El enzima resultó ser bastante similar en su estructura a la glutatión reductasas purificadas previamente de otras fuentes; sin embargo, el marcado carácter ácido de esta proteína es un rasgo característico. 14. Las propiedades catalíticas de la glutatión reductasa de Anabaena sp. 7119, como el valor de pH óptimo mostrado (muy alcalino) y su estricta especificidad por el NADPH, está claramente adaptadas al ambiente celular el donde el producto de la reacción, el GSH, desarrolla una función protectora. 15. El incremento de la actividad glutatión reductasa “in vivo” en condiciones hiperóxicas, y las altas velocidades de desprendimiento de oxígeno dependiente de GSSG obtenidas en sistemas reconstituídos, son coherente, también, con un papel del enzima en los mecanismos de protección contra daños por oxidación, y con la capacidad del glutatión para actuar como reactivo de Hill fisiológico en cianobacterias.