PL: Zastosowanie preparatu enzymatycznego LecitaseTM Ultra do otrzymywania optycznie czynnych alkoholi z układem 4-arylobut-3-en-2-olu | EN: The use of the LecitaseTM Ultra for the preparation of optically active alcohols with the 4-arylbut-3-en-2-ol system

abstractPL: Enzym LecitaseTM Ultra jest produktem fuzji genów fosfolipazy A1 z Fusarium oxysporum i lipazy z Thermomyces lanuginosus, pierwotnie przeznaczonym do przemysłowej rafinacji olejów roślinnych w procesie tzw. odśluzowywania. Jako biokatalizator typowych reakcji przeprowadzanych dotychczas z użyciem komercyjnie dostępnych preparatów lipaz, znajduje on również zastosowanie do produkcji strukturyzowanych fosfolipidów, diacylogliceroli, biodiesla czy estrów o interesujących właściwościach zapachowych. W obszarze syntezy asymetrycznej zastosowanie enzymu LecitaseTM Ultra ograniczone było dotąd do otrzymywania chiralnych kwasów karboksylowych w reakcjach enancjoselektywnej hydrolizy ich racemicznych estrów. Przedmiotem badań realizowanych w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej było zastosowanie preparatu LecitaseTM Ultra do otrzymywania enancjomerycznie wzbogaconych alkoholi z układem (E)-4-arylobut-3-en-2-olu w procesach kinetycznego rozdziału mieszanin racemicznych. Badany enzym testowany był w dwóch układach reakcyjnych: w procesach transestryfikacji racemicznych alkoholi oraz hydrolizy ich estrów. Pierwszy etap badań dotyczył zastosowania komercyjnej formy enzymu w postaci wyciągu wodnego w reakcjach hydrolizy racemicznych estrów (E)-4-fenylobut-3-en-2-olu. Najwyższe stopnie konwersji substratów i czystości optyczne produktów hydrolizy osiągnięto w temperaturze 20°C w buforze fosforanowym z dodatkiem acetonu jako kosolwentu. Dodatkowo wykazano dodatnią korelację pomiędzy wzrostem długości łańcucha acylowego hydrolizowanego estru a czystością optyczną uzyskanych produktów. Kolejne eksperymenty poprzedzono unieruchomieniem enzymu na różnych nośnikach, takich jak żywica poliakrylowa, alginian wapnia, modyfikowana celuloza bakteryjna oraz agaroza aktywowana bromocyjanem. Wykorzystanie immobilizowanych preparatów LecitaseTM Ultra jako biokatalizatorów w reakcjach hydrolizy znacząco zwiększyło czystości optyczne uzyskanych produktów oraz skróciło czas potrzebny do efektywnego rozdziału testowanych substratów z 96-168 h do 24–48 h. Najlepsze wyniki odnotowano z udziałem enzymu unieruchomionego na agarozie aktywowanej bromocyjanem (LU-CNBr), uzyskując enancjomerycznie wzbogacone alkohole i estry o nadmiarach enancjomerycznych 94-99%. Spośród unieruchomionych preparatów LU-CNBr okazał się również najbardziej efektywnym biokatalizatorem w procesie transestryfikacji (E)-4-fenylobut-3-en-2-olu. Najlepsze wyniki pod względem enancjoselektywności reakcji (E>200) oraz czystości optycznych produktów (ee 97-99%) zaobserwowano po 24 godzinach procesu w eterze diizopropylowym w obecności propionianu winylu. Uzyskany preparat okazał się uniwersalny zarówno w szerokim zakresie rozpuszczalników organicznych jak i powszechnie stosowanych estrów enoli jako dawców grupy acylowej. Wykazano również możliwość trzykrotnego użycia immobilizowanego preparatu LU-CNBr w procesie transestryfikacji bez negatywnego wpływu na efektywność kinetycznego rozdziału (E)-4-fenylobut-3- en-2-olu. W toku badań stwierdzono, iż budowa fragmentu aromatycznego wpływa na rozdział mieszanin racemicznych zarówno w przypadku alkoholi z układem (E)-4-arylobut-3-en-2-olu, jak również ich estrów. Wysokie nadmiary enancjomeryczne produktów rozdziału (95-99%) uzyskano dla związków z podstawnikiem 2,5-dimetylofenylowym, a wyraźnie niekorzystny wpływ obserwowano w przypadku kinetycznego rozdziału związków z grupą metoksylową w pozycji para pierścienia benzenowego. Poprzez porównanie znaków skręcalności właściwych otrzymanych produktów z danymi literaturowymi wykazano enancjopreferencję preparatu LecitaseTM Ultra względem (R)-enancjomerów rozdzielanych związków, zgodną z obowiązującą dla większości lipaz regułą Kazlauskasa.Uzyskane wyniki, opublikowane w trzech oryginalnych artykułach naukowych wskazują, że preparat LU-CNBr stanowi interesującą alternatywę dla powszechnie stosowanych lipaz jako nowy biokatalizator kinetycznego rozdziału racemicznych alkoholi allilowych z układem (E)-4-arylobut-3-en- 2-olu oraz ich estrów.

abstractEN: The LecitaseTM Ultra is a product of the genes fusion of phospholipase A1 from Fusarium oxysporum and lipase from Thermomyces lanuginosus, originally designed for the industrial refining of vegetable oils in the proces of degumming. As a biocatalyst of typical reactions carried out so far with the use of commercially available lipase preparations, it is also used for the production of structured phospholipids, diacylglycerols, biodiesel or esters with interesting aroma properties. In the area of asymmetric synthesis, the use of the LecitaseTM Ultra enzyme has been limited to the preparation of chiral carboxylic acids by enantioselective hydrolysis of their racemic esters. The subject of the research carried out as part of this doctoral dissertation was the use of LecitaseTM Ultra for the preparation of enantiomerically enriched alcohols with the (E)-4-arylbut-3-en-2-ol system in the kinetic resolution of racemic mixtures. The enzyme was tested in two reaction systems: in the transesterification of racemic alcohols and the hydrolysis of their esters. The first stage of the research concerned the use of a commercial form of the enzyme in the form of anaqueous extract in the hydrolysis reactions of racemic esters of (E)-4-phenylbut-3-en-2-ol. The highest degrees of substrate conversion and optical purities of the hydrolysis products were achieved at 20 °C in a phosphate buffer with the acetone as a cosolvent. Additionally, a positive correlation was demonstrated between the increase in the length of the acyl chain of the hydrolyzed ester and the optical purity of the products obtained. Subsequent experiments were preceded by the immobilization of the enzyme on various carriers, such as polyacrylic resin, calcium alginate, modified bacterial cellulose and cyanogens bromide agarose. The use of immobilized LecitaseTM Ultra preparations as biocatalysts in hydrolysis reactions significantly increased the optical purity of the obtained products and reduced time necessary for an effective separation of the tested substrates from 96-168 h to 24-48 h. The best results were obtained with the enzyme immobilized on cyanogens bromide agarose (LU-CNBr), yielding enantiomerically enriched alcohols and esters with enantiomeric excesses of 94-99%. Among the immobilized preparations, LU-CNBr also turned out to be the most effective biocatalyst in the transesterification process of (E)-4-phenylbut-3-en-2-ol. The best results in terms of the enantioselectivity of the reaction (E>200) and the purity of optical products (ee 97-99%) were observed after 24 h of the process in diisopropyl ether in the presence of vinyl propionate. The obtained enzyme preparation turned out to be universal both in a wide range of organic solvents and enol esters commonly used as the acyl donors. It was also demonstrated that the immobilized LU- CNBr preparation could be used three times in the transesterification process without affecting the efficiency of the kinetic resolution of (E)-4-phenylbut-3-en-2-ol. In the course of the research it was shown that the structure of the aromatic fragment influences the resolution of racemic mixtures both in the case of alcohols with the (E)-4-arylbut-3-en- 2-ol system and their esters. High enantiomeric excesses of the separation products (95-99%) were obtained for compounds with a 2,5-dimethylphenyl substituent, and a clearly unfavourable effect was observed in the case of kinetic separation of compounds with the methoxy group in the para position of the benzene ring. By comparing the signs of specific rotation mesured for the obtained products with the literature data, the enantiopreference of LecitaseTM Ultra towards the (R)-enantiomers of the resolved compounds was demonstrated, which was consistent with the Kazlauskas rule applicable for most lipases.The obtained results, published in three original scientific articles, indicate that the LU-CNBr preparation is an interesting alternative to the commonly used lipases as a new biocatalyst for the kinetic resolution of racemic allyl alcohols with the (E)-4-arylbut-3-en-2-ol system and their esters.

status: finished

collation: 71