PL: Badanie zdolności fizjologicznych drożdży Yarrowia lipolytica do rozkładu tworzyw sztucznych | EN: Investigation of the ability of the Yarrowia lipolytica yeast to degrade plastic materials

abstractPL: Zanieczyszczenie planety odpadami z tworzyw sztucznych jest w ostatnich latach coraz bardziej dostrzegalne. Zwiększona produkcja i wykorzystanie tych materiałów w wielu dziedzinach przemysłu, połączone z niedopracowanym systemem zarządzania odpadami sprawiły, że coraz więcej ekosystemów odczuwa bolesne skutki akumulacji tychże śmieci. Jednym z najbardziej powszechnych tworzyw sztucznych na świecie jest poli(tereftalan etylenu) (PET), polimer o bardzo dobrych właściwościach fizyko-chemicznych, który jest uważany za niebiodegradowalny. Obecnie, naukowcy prowadzą wzmożone badania mające na celu rozwiązać ten realny i narastający problem a dotychczasowym rezultatem było określenie enzymów z klasy hydrolaz, takich jak kutynazy, lipazy i PETaza, jako zdolnych do hydrolizy wiązań estrowych obecnych z poliestrach (P1). Niniejsza praca skupia się na badaniu zdolności zmodyfikowanych drożdży Yarrowia lipolytica do rozkładu tworzyw sztucznych i ma na celu wprowadzenie nowatorskiej metody degradacji poliestrów bezpośrednio w hodowli mikroorganizmów. W pierwszej fazie badań koncentrowano się na degradacji poliestrów alifatycznych, w której wykorzystano szczep drożdży Y. lipolytica produkujący pozakomórkowo kutynazy z F. solani i T. reesei z koekspresją natywnej lipazy (P2). Badania w tym zakresie dotyczyły aktywności enzymatycznej enzymów obecnych w supernatancie pochodzącym z hodowli, ich zdolności do tworzenia stref przejaśnień na emulgowanym podłożu poliestrowym (poli ε-kaprolaktonu; PCL), ilościowego oznaczania ilości uwalnianego ε-kaprolaktonu w procesie rozkładu oraz ubytku masy biodegradowalnych folii z tworzywa sztucznego po hodowli ze zmodyfikowanymi szczepami. W niniejszych badaniach ustalono, że szczepem wyróżniającym się wysokim poziomem biodegradacji poliestrów jest szczep Y. lipolytica z nadekspresją kutynazy z F. solani (AJD2 pAD CUT_FS), wykorzystany również do biodegradacji PET (P3). Ponieważ PETaza z Ideonella sakaiensis nie wykazuje zdolności do hydrolizy wiązań estrowych obecnych w poliestrach alifatycznych (takich jak PCL), szczep produkujący ten enzym, wraz ze szczepem wybranym w pierwszym etapie badań, został wykorzystany do oceny zdolności degradacyjnych tworzywa PET (P4). Proces rozkładu PET został przeprowadzono bezpośrednio w hodowli zmodyfikowanych szczepów Y. lipolytica. Dodatkowo zbadano wpływ suplementacji na wydajność degradacji, stosując różne stężenia soli oraz oliwy z oliwek. Efektywność degradacji tworzyw sztucznych określono na podstawie ilości uwolnionych produktów hydrolizy PET, takich jak kwas tereftalowy (TPA) oraz kwas mono-(2-hydroksyetylowy)tereftalowy (MHET) przy użyciu ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC). Dodatkowo zbadano również zdolność do asymilacji końcowych produktów degradacji PET (takich jak TPA, EG) przez Y. lipolytica i porównano zdolność do hydrolizy MHET przez zmodyfikowane szczepy kutynazę z F. solani i PETazę z I. sakaiensis. Ponadto przeprowadzono hodowlę drożdży z folią PET, a strukturę jej powierzchni na folii sprawdzono za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM). Badania przeprowadzone w ramach tej pracy wskazują, że Y. lipolytica jest odpowiednim kandydatem, który może być wykorzystany jako organizm gospodarza do pozakomórkowej produkcji enzymów hydrolizujących poliestry. Ze względu na stabilizację pH podłoża hodowlanego po 72 h hodowli w zakresie optymalnych warunków środowiskowych dla obu stosowanych enzymów (pH 8,0-8,5) wykazano, że proces degradacji tworzyw sztucznych może być wydajnie przeprowadzony bezpośrednio w hodowli mikroorganizmów. Dodatkowo w naszych badaniach wykazaliśmy, że Y. lipolytica jest zdolna do asymilacji glikolu etylenowego (EG), który wraz z TPA jest końcowym produktem hydrolizy tego polimeru.

abstractEN: Pollution of the planet with plastic waste has become increasingly apparent in recent years. The increased production and use of such materials in a wide range of industries, combined with an underdeveloped waste management system, has resulted in an increasing number of ecosystems being harmed by the accumulation of this litter. One of the most common plastics in the world is poly(ethylene terephthalate) (PET), which is considered a non-biodegradable polymer with outstanding physical and chemical properties. Currently, scientists are undertaking intensive research aiming at solving this feasible and escalating problem and to date, the results were the identification of enzymes from the hydrolase class, such as cutinases, lipases and PETase, as capable of hydrolyzing the ester bonds present in polyesters (P1|). The current work focuses on examining the ability of modified Yarrowia lipolytica yeast to degrade plastics and aims to introduce a novel method for degrading polyesters directly in microbial culture. The increased production and use of plastics in recent years has resulted in their significant accumulation in the environment, which negatively affects the entire ecosystem. One of the world’s most common plastic material is poly(ethylene terephthalate) (PET) is one of the world’s most widely used plastic material with wide range of usage i.e. packaging, construction and automotive industry. To the date, the enzymes from hydrolase class such as cutinases, lipases and PETase were classified as capable to hydrolyze ester bonds present in polyesters. First, the research was focused on aliphatic plastic degradation, where Y. lipolytica yeast strain extracellularly producing cutinases from F. solani and T. reesei with co-expression with native Y. lipolytica lipase (P2). The work within this scope focused on investigation the enzymatic activity of the enzymes present in the culture’s supernatant, the capacity to form clear zones on the emulsified polyester substrate medium, the quantitative assay of the amount of released ε-caprolactone during decomposition process, and the mass loss of biodegradable plastic films. In this study, we have determined the best candidate for further work with more challenging plastic material is a strain producing cutinase from F. solani, employed also for biodegradation of PET (P3). Considering that PETase from Ideonella sakaiensis does not exhibit the ability to hydrolyze ester bonds present in aliphatic polyesters, the strain producing this enzyme, along with the strain selected in the first stage of the studies, was used to examine degradation of PET material (P4). The investigation of the capacity to hydrolyze this plastic were performed directly in the culture of the above-mentioned Y. lipolytica engineered strains. In addition, we have tested the supplementation influence on the degradation efficiency with the use of various salts and olive oil at different concentrations. Plastic degradation capacity by Y. lipolytica strains was determined based on the amount of released PET hydrolysis products such as terephthalic acid (TPA), mono-(2-hydroxyethyl) terephthalic acid (MHET) and with the use of ultraperformance liquid chromatography (UPLC). Furthermore, we have also investigated the ability to assimilate terminal PET degradation products by Y. lipolytica and compared the ability to hydrolyze MHET by modified strains producing cutinase from F. solani and PETase from I. sakaiensis. Finally, the yeast culture with PET film was carried out and the structure of the film was verified by scanning electron microscopy. The research conducted in this thesis indicates that Y. lipolytica is a highly suitable candidate which may be used as a host organism for the extracellular production of enzymes hydrolyzing polyesters. Due to the stabilization of the pH of the culture medium after 72 h of culture within the range of optimal environmental conditions for both enzymes used (pH 8.0-8.5), plastic degradation process can be accomplished directly in the microbial culture. Additionally, in our study we have demonstrated that Y. lipolytica is able to assimilate ethylene glycol (EG), which, along with TPA, is the final product of the hydrolysis of this polymer.

status: finished

collation: 45