Dissecting the tumor radioresistance in triple-negative breast cancer | Dissecar a radioresistência no cancro da mama triplo-negativo

Triple-negative breast cancer (TNBC), the most aggressive and radioresistant subtype of breast cancer, is associated with a high risk of relapse following radiotherapy (RT). The tumor microenvironment (TME) consists not only of tumor cells but of a different type of cell population populations, including infiltrating immune cells, that are also a target and have influence in the efficacy of RT. TNBC tumors are highly infiltrated with macrophages, that are associated with therapy resistance and a worse prognosis. Therefore, uncovering the macrophage-mediated molecular mechanisms behind TNBC radioresistance will reveal new targets for radiosensitizing therapies and improve disease management. At the same time, understanding the underlying mechanisms and alterations driving tumor cell radioresistance is also essential for developing a more precise and effective treatment strategy. Therefore, our work focuses on the development of experimental models to study radioresistance mechanisms in TNBC. Firstly, as previously reported by our team, we have successfully established 3D in vitro tumor and tumor-immune spheroids, using liquid overlay technique, with TNBC MDA-MB-231 cell line and human macrophages, isolated from healthy donors’ buffy coats. These spheroids were subjected to the RT scheme of 5x5.2 Gy, mimicking a week of patients’ treatment. After 24h of the last irradiation, we unveil that macrophages confer protection from RT to tumor cells. The presence of macrophages not only maintained tumor cell viability, but also increased tumor cell proliferation. To better understand if this effect is cell line dependent, we established tumor spheroids and tumor-immune spheroids with TNBC BT-20 cell line. After 8 days, viability, metabolic activity, morphology, and response to RT were assessed. With this we found that the high proliferation ratio of BT-20 cell line impacts the viability of human macrophages in TIS model, not allowing for the same protective effect than observed in MDA-MB-231 TIS. In parallel, we developed radioresiresistant (RR) cell lines of parental radiosensitive (RS) MDA-MB-231 and Hs578T cell lines. For this, cells received intermittent single doses of irradiation of 2 → 4 Gy, in the first week with a 2-day interval, and weekly single doses of 6 → 8 → 10 → 10 → 10Gy, totalizing a radiation dose of 50Gy irradiated, as previously described in other studies. Then, morphology and colony formation capacity of both RR cell lines was assessed and both RR cell lines have higher colony formation capacities than parental cell lines, at some of these doses. Additionally, migration and invasion capacities of the RR cell lines were assessed. On both a collective and single-cell level, RR cell lines demonstrated an increase in migration capacity. In relation to invasion capacity, while no differences were seen in the Hs578T RR cell line, the MDA-MB-231 RR cell line had an increase in invasion when compared to the parental RS cell line. Lastly, the expression of gelatinases (MMP-2 and MMP-9) revealed no significant difference in MDA-MB-231 RR when compared to the parental RS cell line, indicating that other molecular mechanisms may be involved in the increase of invasion of this cell line. With this thesis, we developed new tools, 3D models and RR cell lines, that allow to better understand the role of macrophages on radioresistance, as well as understand the underlaying mechanisms of radioresistance in TNBC cells. In this way, this work paves the way to identify new therapeutic targets, that in the future may allow for a better survival rate and quality of life for these patients.

O cancro da mama triplo-negativo (CMTN) é o subtipo mais agressivo e radioresistente de cancro da mama e está associado a um maior risco de reincidência após radioterapia (RT). O microambiente tumoral (TME) não é constituído apenas por células tumorais, mas também por outros tipos celulares, incluindo células imunes infiltradas, que também são alvo da ação da RT e influenciam a sua eficácia. O CMTN exibe frequentemente uma alta infiltração de macrófagos que, por sua vez, estão associados a resistência terapêutica e a um pior prognóstico. Assim, a compreensão dos mecanismos pelos quais os macrófagos medeiam resistência à RT, poderá revelar novos alvos terapêuticos, melhorando a resposta dos pacientes ao tratamento. Além disso, é crucial compreender os mecanismos e alterações basais das células tumorais radioresistentes para possibilitar um tratamento mais preciso e eficaz. Assim, o nosso trabalho concentra-se no desenvolvimento de modelos para estudar os mecanismos de radioresistência no CMTN. Primeiramente, como reportado anteriormente pela nossa equipa, estabelecemos modelos 3D in vitro de immuno-esferóides através da técnica de sobreposição líquida, conjugando a linha celular MDA-MB-231 de CMTN com monócitos, isolados de dadores de sangue saudáveis. Estes immuno-esferóides foram submetidos a um esquema de RT de 5x5.2 Gy, mimetizando uma semana de tratamento dos pacientes com CMTN. Após 24h depois da última irradiação, conseguimos revelar que os macrófagos conferem um efeito protetor da RT às células tumorais. A presença de macrófagos, não só manteve a viabilidade celular das células tumorais, como aumentou a proliferação das mesmas. Para compreender se este efeito é dependente da linha celular utilizada, desenvolvemos e caracterizamos immuno-esferóides com outra linha celular de CMTN, nomeadamente, a linha celular BT-20. Após 8 dias de cultura celular, a viabilidade, morfologia, atividade metabólica e resposta à RT foram avaliadas. Assim, percebemos que o elevado rácio de proliferação celular das células BT-20 afeta a infiltração e viabilidade dos macrófagos no modelo de esferóide, e que o efeito protetor à RT anteriormente reportado não se verifica nestes immuno-esferóides. Em paralelo, devolvemos linhas celulares radioresistentes (RR) a partir de linhas celulares parentais radiossensíveis (RS) MDA-MB-231 e Hs578T, administrando doses únicas de irradiação de 2 → 4 Gy, durante a primeira semana e com um intervalo de 2 dias, e doses únicas semanais de irradiação de 6 → 8 → 10 → 10 → 10Gy, até um total de 50 Gy, como previamente descrito na literatura. Para validar a aquisição de radioresistência, a morfologia e a capacidade de formação de colónias de ambas as linhas celulares foram avaliadas e ambas as linhas celulares RR demostraram capacidade superior na formação de colónias, em algumas das doses de irradiação, quando comparadas com as linhas parentais. Adicionalmente, a capacidade de migração e de invasão das linhas celulares estabelecidas, foram avaliadas. As linhas RR mostraram um aumento em ambos os tipos de migração, tanto coletiva como unicelular. Relativamente à invasão, as células MDA-MB-231 RR são mais invasivas do que as suas parentais, enquanto as HS578T RR mostraram a mesma capacidade invasiva quando comparadas com as parentais. Por último, a expressão de gelatinases, nomeadamente da matriz metaloproteinase 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) nas diferentes linhas foi avaliada, mas não foram encontradas diferenças na expressão, sugerindo a existência de outros mecanismos associados ao aumento da capacidade invasiva das MDA-MB-231 RR. Assim, esta tese possibilitou o desenvolvimento de novas ferramentas experimentais para aprofundar a compreensão do papel dos macrófagos na aquisição de radioresistência, bem como o papel dos mecanismos intrínsecos de radioresistência das células tumorais de CMTN. Dessa forma, este trabalho abre caminho para a identificação de novos alvos terapêuticos, visando melhorar a qualidade de vida e a sobrevivência dos pacientes.

Mestrado em Biomedicina Molecular