Interbacterial competition assays have become an essential tool for understanding the interactions between bacteria and their ability to outcompete one another in natural environments. This is especially relevant when studying the type VI secretion system (T6SS), a contact-dependent bacterial weapon that can be used to kill or inhibit the growth of other competing bacteria. Some beneficial environmental microorganisms such as Pseudomonas putida rely on the T6SS as their primary biocontrol mechanism to eliminate resilient plant pathogens. Competition assays are an essential methodology in this field that allows us to understand the efficacy of this bacterial nanoweapon. This chapter outlines the methodology for conducting in vitro and in planta competition assays between P. putida, a well-known biocontrol agent, and phytopathogenic bacterial species of economic and scientific interest.

The SARS-CoV-2 pandemic has to date resulted in almost 7 million deaths worldwide and a much higher number of hospitalizations. Thanks to a global collective dedication and understanding of the need, new and efficient vaccines were rapidly available on the market. However, two doses were needed for protective efficacy in large parts of the population, and we still have large uncertainties with respect to what type of immune responses would be the most relevant correlate of protection in different population groups. Here, we sought to characterize the immune responses elicited when steering the Spike antigen to selected receptors expressed on APCs. The aim was to describe the different types of immune responses associated with the selective APC steering. Further, we wanted to evaluate the induction of cross-reactive antibodies after vaccination of mice. We found that steering the antigen towards distinct APC receptors resulted in increased cellular and humoral responses. In addition, the elicited responses were polarized based on the specific APCs which was targeted and were readily characterized. Lastly, steering the different Spike variant antigens to MHCII expressing cells resulted in production of cross-reactive antibodies. Based on these findings, we conclude that the type of immune response initiated by APC targeted vaccination can be influenced by the choice of APC receptor ligand. This advantageous knowledge can be used to produce vaccines specifically tailored to match the immune response wanted in different population groups with different needs. In addition, APC targeted vaccines can also be used to induce production of cross-reactive antibodies.

Glandular cancers are amongst the most prevalent types of cancer, which can develop in many different organs, presenting challenges in their detection as well as high treatment variability and failure rates. For that purpose, anticancer drugs are commonly tested in cancer cell lines grown in 2D tissue culture on plastic dishes in vitro, or in animal models in vivo. However, 2D culture models diverge significantly from the 3D characteristics of living tissues and animal models require extensive animal use and time. Glandular cancers, such as prostate cancerâ the second leading cause of male cancer deathâ typically exist in co-centrical architectures where a cell layer surrounds an acellular lumen. Herein, this spatial cellular position and 3D architecture, containing dual compartments with different hydrogel materials, is engineered using a simple co-axial nozzle setup, in a single step utilizing prostate as a model of glandular cancer. The resulting hydrogel soft structures support viable prostate cancer cells of different cell lines and enable over-time maturation into cancer-mimicking aggregates surrounding the acellular core. The biofabricated cancer mimicking structures are then used as a model to predict the inhibitory efficacy of the poly ADP ribose polymerase inhibitor, Talazoparib, and the antiandrogen drug, Enzalutamide, in the growth of the cancer cell layer. Our results show that the obtained hydrogel constructs can be adapted to quickly obtain 3D cancer models which combine 3D physiological architectures with high-throughput screening to detect and optimize anti-cancer drugs in prostate and potentially other glandular cancer types. | FCT -Fuel Cell Technologies Program(NORTE-01-0145-FEDER-000039)

Periodontal diseases are chronic inflammatory conditions that affect the supporting tissues of the teeth and can lead to tooth loss if not treated properly, representing a global public health problem with high prevalence rates. Current treatments involve surgical and non-surgical interventions focused on controlling inflammation and removing bacterial biofilm. However, although effective, conventional treatments face challenges in local administration due to the low retention of drugs in the oral cavity because of the action of saliva, which implies the need for multiple applications. Thus, administration systems are needed to solve conventional methods’ limitations, such as microneedles. Microneedles offer advantages such as the ability to penetrate the gingival tissues in a minimally invasive, painless way and provide controlled and precise administration of the drugs directly into the gingival tissues. In addition, microneedles can overcome drug retention problems, improving treatment efficacy and reducing the need for multiple applications. This dissertation proposes an innovative approach based on the fabrication of hydroxyapatite microneedles patches using the LCM-DLP technique, in specific and optimized designs, including conical, anchored, and hollow with a vat container, as an effective solution for the treatment of periodontal diseases. The analyses conducted, namely scanning electron microscopy (SEM), micro-computed tomography (Micro-CT), and mechanical properties tests, were carried out to assess the dimensional and structural quality of the micro-needles. The results demonstrated the viability of this technology in producing conical and anchored ceramic structures. However, the production of hollow micro-needles with internal channels faced challenges. This work confirms the potential of the LCM-DLP technique in the production of solid microneedles for biomedical applications, although further adjustments are required for the efficient production of hollow microneedles. | As doenças periodontais são condições inflamatórias crónicas que afetam os tecidos de suporte dos dentes, podendo levar à perda dentária se não tratadas adequadamente, representando um problema de saúde pública global com altos índices de prevalência. Os tratamentos atuais envolvem intervenções cirúrgicas e não cirúrgicas com foco no controlo da inflamação e remoção do biofilme bacteriano. No entanto, os tratamentos convencionais apesar de eficazes, enfrentam desafios na administração local devido à baixa retenção de fármacos na cavidade oral devido à ação da saliva que, consequentemente, implica a necessidade de múltiplas aplicações. Desta forma, são necessários sistemas de administração que possam solucionar as limitações dos métodos convencionais, como é o caso das microagulhas. As microagulhas oferecem vantagens como a capacidade de penetrar nos tecidos gengivais de forma minimamente invasiva, indolor, proporcionam uma administração controlada e precisa dos fármacos diretamente nos tecidos gengivais. Além disso, as microagulhas podem superar os problemas de retenção de fármacos, melhorando a eficácia do tratamento e reduzindo a necessidade de múltiplas aplicações. Esta dissertação porpõe uma abordagem inovadora baseada na fabricação de patches de microagulhas de hidroxiapatite a partir da técnica LCMDLP, em formatos específicos e otimizados, incluindo o formato cónico, ancorado e ocas com um reservatório, como uma solução eficaz para o tratamento de doenças periodontais. As análises conduzidas, nomeadamente a microscopia eletrónica de varrimento (SEM), a microtomografia computadorizada (Micro-CT) e os testes de propriedades mecânicas, foram realizados para avaliar a qualidade dimensional e estrutural das microagulhas. Os resultados demonstraram a viabilidade desta tecnologia para a produção de estruturas cerâmicas de formato cónico e ancorado. No entanto, a produção de microagulhas ocas com canais internos enfrentou alguns desafios. Este trabalho confirma o potencial da técnica LCM-DLP na produção de microagulhas sólidas para aplicações biomédicas, embora sejam necessários ajustes adicionais para a produção eficiente de microagulhas ocas. | Apoio financeiro do POCTI no âmbito do III Quadro Comunitário de Apoio. Apoio financeiro da FCT e do FSE no âmbito do III Quadro Comunitário de Apoio. | Mestrado em Engenharia Biomédica

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, área científica de Clínica | ABSTRACT - Equine Asthma Syndrome (EAS) represents a prevalent chronic respiratory condition. In this syndrome, neutrophils have a role in both tissue damage and clinical signs. While most of the times glucocorticoids can control Equine Asthma Syndrome (EAS) exacerbations and are considered the standard treatment, some horses show resistance, leading to therapeutic failure, and side effects. Themainobjective of this pilot study was to determine whether orally administered oclacitinib (0.25 mg/kg bwt q.d., Apoquel®16mg tablets, Zoetis1) improved the Tilley et al. (2012) score and the BAL neutrophil % in horses diagnosed with EAS by first-opinion veterinarians and referred to the equine teaching hospital of FMV/ULisboa for glucocorticoid-resistant EAS. Six privately owned horses initiated a 2 week protocol treatment with dexamethasone (stan dard treatment). At the end of this protocol, the clinical signs remained. Two weeks after, they began the new treatment protocol with oclacitinib in which they were given the oral dose of oclacitinib (mentioned above) for a period of 28 days. If clinical signs improved by day 28, the dosage continued every other day until day 56. Asthma staging, carried out using the Tilley et al. (2012) protocol, and bronchoalveolar lavage (BAL) cytology were performed on days 0 and 56. On days 28 and 180, Clinical scores were also recorded. On day 56, six horses showed an average total score improvement of 69%±34%, with sig nificant improvements in clinical (83%±37%) and endoscopic (100%±0%) scores observed at the end of the treatment, when compared to day 0. Two-thirds (n=4) of the horses showed no significant differences when switched to alternate-day dosing. Only one horse did not reach an EASstage 0 (total score ≤ 4) by day 56. BAL cytology revealed a predominance of neutrophils in all samples on day 0, with a 30% average decrease after two months of treatment. These findings suggest that oclacitinib improves clinical signs in horses with glucocorticoid resistant EAS when environmental allergen exposure is controlled. No significant differences in leukogram values were detected over 6 months of follow up period. Further studies are still needed to confirm its efficacy and long-term safety | RESUMO - FIRST EVALUATION OF THE USE OF OCLACITINIB IN THE TREATMENT OF EQUINE ASTHMA PATIENT NON-RESPONSIVE TO GLUCOCORTICOIDS: EQUINE ASTHMA STAG ING - A Síndrome de Asma Equina (SAE) representa uma condição respiratória crónica. Nesta síndrome, os neutrófilos atuam tanto na lesão dos tecidos como nos sinais clínicos. Apesar dos glucocorticoides serem eficazes na maioria das vezes no controlo de episódios críticos de Síndrome de Asma Equina, alguns cavalos apresentam resistência a este tratamento, levando a falhas terapêuticas e efeitos adversos. O principal objetivo deste estudo piloto foi determinar se a administração oral de Oclacitinib (0,25 mg/kg bwt q.d., comprimidos Apoquel®16mg, Zoetis) melhorava a pontuação Tilley et al. (2012) e a % de neutrófilos no lavado broncoalveolar (LBA) em cavalos diagnosticados por médicos veterinários de 1ª opinião e encaminhados para o hospital escolar de equinos da FMV-ULisboa por SAE resistente a glucocorticoides. Seis cavalos foram sujeitos a um protocolo de tratamento de 2 semanas com dexametasona. No fim desse protocolo, os sinais clínicos mantiveram-se. Duas semanas depois iniciaram o protocolo do tratamento com oclacictinib em que o receberam diariamente durante 28 dias. Havendo remissão dos sinais clínicos nesse período, a administração passava para dias alter nados até ao dia 56. O estadiamento da asma, realizado pelo protocolo de Tilley et al. (2012), e a citologia do LBA foram realizados nos dias 0 e 56. Nos dias 28 e 180, as pontuações clínicas foram registadas. No dia 56, os 6 cavalos apresentaram uma melhoria média na pontuação total de 69% ± 34%, com melhorias na pontuação clínica (83%±37%) e endoscópica (100%±0%) em comparação com o dia 0. Dois terços dos cavalos (n=4) não apresentaram diferenças relevantes ao mudar para a administração em dias alternados. Ao dia 56, apenas um cavalo não alcançou o estadio 0 de SAE (pontuação total ≤ 4). A citologia do LBA revelou uma predominância de neutrófilos em todas as amostras no dia 0, com uma redução média de 30% após 2 meses de tratamento. Estes resultados sugerem que o Oclacitinib melhora os sinais clínicos em cavalos com SAE resistente a glucocorticoides quando a exposição a alérgenos ambientais é controlada. Não foram detetadas alterações relevantes nos valores do leucograma ao longo dos 6 meses. Mais estudos são necessários para confirmar a sua eficácia e segurança a longo prazo | Zoetis | N/A

Glutamate excitotoxicity leads to neuronal cell death and plays an important role in the pathogenesis of several conditions, such as stroke, Huntington’s disease, amyotrophic lateral sclerosis among others. Stroke is the second leading cause of mortality and the third leading cause of disability worldwide. The existing treatments have a narrow time-window for administration and are of limited efficacy. Since glutamate excitotoxicity underlies the ischemic stroke injury cascade, a neuroprotective drug that decreases excitotoxicity could contribute significantly to the treatment of this disease. However, developing a new drug is a slow and expensive process, so drug repurposing is a growing strategy to find new drugs and develop new treatments. Since repurposed drugs are already in a final phase of clinical or in the market, the process is less complex. However, identifying new roles for exiting drugs is not a simple process, since the number of available molecules is extremely high. So, in order to test a high quantity of drugs quickly, high-throughput screening is a good solution. It allows to reduce the number of possible drugs and focus on the ones that show a significant effect. Therefore, we developed a high-throughput screening to identify a potential neuroprotective drug against glutamate-induced excitotoxicity and identified 23 compounds with potential neuroprotective effect. These compounds were subsequently analyzed for a previously described effect in excitotoxicity/ischemia/stroke. Our results show that 16 compounds have a described protective effect in excitotoxicity/ischemia/stroke, which validates the pipeline developed in this study. Additionally, the high-throughput screen developed under the scope of this project identified 7 new drugs that have not been studied in this context. These molecules showed a neuroprotective effect against glutamateinduced excitotoxicity and a secondary screen validated the initial neuroprotective effects. Taken together the results identified 7 FDA-approved compounds that may potentially be used to treat ischemic stroke. These drugs can potentially be used in the future as a therapeutic strategy in stroke therapies. | A excitotoxicidade do glutamato leva à morte de células neuronais e desempenha um papel importante na patogénese de várias doenças, como o acidente vascular cerebral (AVC), a doença de Huntington, a esclerose lateral amiotrófica, entre outras. O AVC é a segunda principal causa de mortalidade e a terceira principal causa de incapacidade a nível mundial. Os tratamentos existentes têm uma janela de tempo estreita para administração e são de eficácia limitada. Uma vez que a excitotoxicidade do glutamato está na base da cascata de lesões do AVC isquémico, um fármaco neuroprotetor que diminua a excitotoxicidade poderia contribuir significativamente para o tratamento desta doença. No entanto, o desenvolvimento de um novo fármaco é um processo lento e dispendioso, pelo que o reposicionamento de fármacos é uma estratégia crescente para encontrar novos fármacos e desenvolver novos tratamentos. Uma vez que os medicamentos reposicionados já se encontram numa fase final de tratamento clínico ou no mercado, o processo é menos complexo. No entanto, identificar novas funções para os medicamentos existentes não é um processo simples, uma vez que o número de moléculas disponíveis é extremamente elevado. Assim, para testar rapidamente uma grande quantidade de medicamentos, o highthroughput screening é a uma boa estratégia. Permite reduzir o número de fármacos possíveis e focar nos que mostram um efeito significativo. Assim, desenvolvemos um high-throughput screeníng para identificar potenciais fármacos neuroprotetores contra a excitotoxicidade induzida pelo glutamato e identificámos 23 compostos com potencial efeito neuroprotetor. Estes compostos foram subsequentemente analisados para um efeito previamente descrito na excitotoxicidade / isquémia/AVC. Os nossos resultados mostram que 16 compostos têm um efeito protetor descrito na excitotoxicidade / isquémia/AVC, o que valida a pipeline desenvolvida neste estudo. Adicionalmente, o high-throughput screen desenvolvido no âmbito deste projeto identificou 7 novos fármacos que ainda não tinham sido estudados neste contexto. Estas moléculas mostraram um efeito neuroprotetor contra a excitotoxicidade induzida pelo glutamato e um secondary screen validou os efeitos neuroprotetores iniciais. No seu conjunto, os resultados identificaram 7 compostos aprovados pela FDA que podem ser potencialmente utilizados no tratamento do AVC isquémico. Estes fármacos podem potencialmente ser utilizados no futuro como estratégia terapêutica no tratamento do AVC. | Mestrado em Engenharia Biomédica

Este estudo, teve como objetivo analisar, as propriedades bioativas e a composição química de diferentes partes da planta Humulus lupulus L. (lúpulo), incluindo flores, folhas e rizomas de duas cultivares (Cascade e Nugget) e um Espontâneo. Os principais parâmetros analisados, foram a capacidade antioxidante, a composição de compostos fenólicos, além da atividade antibacteriana e antifúngica dos extratos. Os resultados demonstraram, que o rizoma da cultivar Nugget, apresentou a maior atividade antioxidante, com um IC50 de 0,0635 mg/mL no ensaio DPPH, seguido pelo rizoma do Espontâneo com 0,079 mg/mL. As folhas também exibiram uma atividade antioxidante, com o IC50 variando entre 0,25 mg/mL (Cascade) e 0,077 mg/mL (Espontâneo). Por outro lado, as flores apresentaram a menor capacidade antioxidante, com valores de IC50 de 0,164 mg/mL (Espontâneo) e 0,39 mg/mL (Nugget). No ensaio de TBARS, que determina a inibição da peroxidação lipídica, os rizomas também se destacaram com 0,0004 mg/mL (Nugget). Em termos de compostos fenólicos, as flores destacaram-se, por apresentar a maior quantidade de compostos fenólicos totais a variar entre 5,74 mg/g (Cascade) e 7,2mg/g (Nugget). A flor da cultivar Cascade, apresentou o maior teor de ácidos fenólicos totais (2,04 mg/g), enquanto o maior conteúdo de flavonoides, foi encontrado nas folhas do Espontâneo (5,5 mg/g). O rizoma também se destacou pela presença de (+) -Catequina, com concentrações de 0,054 mg/g (Cascade), 0,089 mg/g (Espontâneo) e 0,051mg/g (Nugget), compostos que são reconhecidos pelo seu forte potencial antioxidante. A avaliação da atividade antimicrobiana, mostrou variabilidade entre as diferentes partes da planta. Para as duas cultivares e para o espontâneo avaliadas, o rizoma foi a parte da planta que se destacou com maior atividade antimicrobiana, especialmente contra bactérias Gram-positivas, como Listeria monocytogenes com valores de CMI de 0,3 mg/mL na cultivar Cascade e Espontâneo e Enterococcus faecalis com valores de CMI de 2,5 mg/mL (Nugget) e 0,3 mg/mL (Cascade). Também mostrou eficácia moderada, contra bactérias Gram-negativas, como Morganella morganii (CMI de 0,6 mg/mL). Há uma variabilidade considerável, na atividade antifúngica dos extratos das diferentes partes das plantas de lúpulo, com destaque para os extratos de folha e rizoma, que demonstraram melhor potencial antifúngico. É de salientar que apenas o Espontâneo apresentou ação fungistática para o Aspergillus brasiliensis com valores de CMIs entre 2,5 mg/mL (rizoma) e 5mg/mL (folha). Esses resultados indicam que o rizoma de Humulus lupulus L. possui um potencial antioxidante e antimicrobiano promissor, o que pode ser explorado em diversas indústrias, como a farmacêutica e alimentar. As folhas, por sua vez, demonstram um alto teor de compostos bioativos, especialmente os fenólicos, que também têm potencial para aplicações futuras. | This study aimed to analyze the bioactive properties and chemical composition of different parts of the plant Humulus lupulus L. (lupulus), including flowers, leaves and rhizomes of two cultivars (Cascade and Nugget), and Spontaneous. The main parameters analyzed were the antioxidant capacity, the composition of phenolic compounds, in addition to the antibacterial and antifungal activity of the extracts. The results demonstrated that the rhizome of the Nugget cultivars presented the highest antioxidant activity, with an IC50 of 0.0635 mg/mL in the DPPH assay, followed by the rhizome of the Spontaneo 0.079 mg/mL. The leaves also exhibited antioxidant activity with the IC50 ranging between 0.25 mg/mL (Cascade) and 0.077 mg/mL (Spontaneous). On the other hand, flowers had the lowest antioxidant capacity, with IC50 values of 0.164 mg/mL (Spontaneous) and 0.39 mg/mL (Nugget). In the TBARS assay, which determines the inhibition of lipid peroxidation, the rhizomes also stood out at 0.0004 mg/mL (Nugget). In terms of phenolic compounds, the flowers stood out, as they presented the highest amount of total phenolic compounds, ranging between 5.74 mg/g (Cascade) and 7.2 mg/g (Nugget). The flower of the Cascade cultivar had the highest content of total phenolic acids (2.04 mg/g) while the highest content of flavonoids was found in the leaves of the Spontaneo (5.5 mg/g). The rhizome also stood out for the presence of (+)-Catechin, with concentrations of 0.054 mg/g (Cascade), 0.089 mg/g (Spontaneous) and 0.051 mg/g (Nugget), compounds that are recognized for their strong antioxidant potential. The evaluation of antimicrobial activity showed variability between different parts of the plant. For all cultivars and spontaneously evaluated, the rhizome was the part of the plant that stood out with the greatest antimicrobial activity, especially against Gram-positive bacteria, such as Listeria monocytogenes with MIC values of 0.3 mg/mL in cultivars Cascade and Spontaneo and Enterococcus faecalis with MIC values of 2.5 mg/mL (Nugget) and 0.3 mg/mL (Cascade). It also showed moderate efficacy against Gram- negative bacteria such as Morganella morganii (MIC of 0.6 mg/mL). There is considerable variability in the antifungal activity of extracts of the different parts of lupulus plants, with emphasis on leaf and rhizome extracts, which demonstrated better antifungal potential. It should be noted that only the spontaneous variety showed fungistatic action against Aspergillus brasiliensis with MIC values between 2.5 mg/mL (rhizome) and 5mg/mL (leaf). These results indicate that the rhizome of Humulus lupulus L. has a promising antioxidant and antimicrobial potential, which can be explored in various industries, such as pharmaceutical and food. The leaves, in turn, demonstrate a high content of bioactive compounds, especially phenolics, which also have potential for future applications.

Adipose tissue-derived stromal cells (ADSCs) have gained particular interest in the field of veterinary medicine, particularly in bone tissue regenerative applications. ADSCs are a versatile population of multipotent cells with unique characteristics, such as accessibility, abundance, rapid proliferation, regenerative capacity, and the ability to produce bioactive molecules. However, the intricacies of ADSCs characteristics seem to vary depending on the animal species and the specific anatomical site from which they are sourced. ADSCs can be obtained from two main sites – adipose tissue of the subcutaneous and visceral regions (SCAT and VAT, respectively) – which differ in terms of structure, composition, cell content and functionality. However, little attention has been directed towards comprehending the functional diversity of ADSCs isolated from these two sites and the consequential effects on their response to different osteogenic inducers. Hence, this study aimed to characterize the functional activity of osteogenic-induced ADSCs cultures from three different species – cat, dog and horse. Additionally, the impact of two osteogenic conditions – the classic dexamethasone, βglycerophosphate and ascorbic acid combination (DEX), and retinoic acid (RA), were assessed in order to identify the most efficient osteogenic differentiation protocol tailored to each species and anatomical location of origin. The adipose tissue from different anatomical locations, focusing on SCAT and VAT, was isolated, characterized and ADSCs were isolated and grown in the presence of the two osteogenic-inducing conditions, and characterized in terms of proliferation, metabolic activity, morphology and osteogenic activity. Results indicated that the biological profile of adipose tissue, proliferation, and osteogenic functionality of ADSCs differed according to tissue origin and species. Tissue samples from different anatomical locations exhibited different characteristics in terms of cell size, vascularization, and morphology, which probably reflect the differences found in the functionality of isolated ADSCs. Proliferation rates were comparable between SCAT- and VAT-derived ADSCs from cats and horses, with notable differences in cells isolated from dogs. In terms of the osteogenic differentiation potential, in cat-derived populations, VAT-derived ADSCs showed greater osteogenic capacity, particularly with RA, while SCAT-derived ADSCs, particularly in the presence of DEX, showed greater potential in cells isolated from horses. However, VAT-derived ADSCs, in the presence of RA, exhibit an increased osteogenic capacity. Interestingly, in dogs’ cells, the comparative analysis between cells isolated from the two VAT anatomical locations revealed that falciform ligament-derived ADSCs showed greater osteogenic capacity than those from periovarian location, particularly with DEX induction. In conclusion, different characteristics were found in the different anatomical locations of adipose tissue, which may reflect the differences found in the functionality of ADSCs. In addition, data highlighting the importance of the selection of the most appropriate osteogenic induction program for each cell population. Therefore, the harvesting site location must be taken into account in order to optimize ADSCs osteogenic functionality, and thus improve the efficacy of ADSCs-based bone regeneration therapiestailored to each animal species. | As células estromais derivadas do tecido adiposo (ADSCs) têm ganho especial interesse no domínio da medicina veterinária, nomeadamente em aplicações regenerativas dotecido ósseo. As ADSCs são uma população versátil de células multipotentes com características únicas, tais como a acessibilidade, abundância, rápida proliferação, capacidade regenerativa e a sua capacidade de produzir moléculas bioativas. No entanto, as características das ADSCs podem variar dependendo da espécie animal e do local de onde são derivadas. Estas células podem ser obtidas de duas localizações anatómicas principais – das regiões subcutânea e visceral (SCAT e VAT, respetivamente) – que apresentam diferenças quanto à estrutura, composição, conteúdo celular e funcionalidade. No entanto, tem sido dada pouca atenção às diferenças na atividade funcional das ADSCs isoladas destas duas regiões anatómicas, bem como o impacto dessas diferenças na resposta aos diferentes indutores osteogénicos. Pelo exposto, o presente trabalho teve como objetivo caracterizar a atividade funcional das culturas de ADSCs estabelecidas, de três espécies diferentes – gato, cão e cavalo, bem como o efeito de duas condições osteogénicas – o meio clássico suplementado com dexametasona, β-glicerofosfato e ácido ascórbico (DEX), e o meio suplementado com ácido retinóico (RA), de modo a identificar o protocolo de diferenciação osteogénica mais eficiente e adaptado a cada espécie e localização anatómica de origem. O tecido adiposo de localizações anatómicas distintas, com foco no SCAT e VAT foi isolado, caracterizado, e as ADSCs foram isoladas e cultivadas na presença das duas condições osteogénicas indutoras, e caracterizadas em termos de proliferação, atividade metabólica, morfologia e atividade osteogénica. Os resultados demonstraram que o perfil biológico do tecido adiposo, a proliferação e o potencial osteogénico das ADSCs diferem consoante a origem do tecido e a espécie. De um modo geral, as ADSCs obtidas de distintas localizações anatómicas apresentam diferentes características quanto ao tamanho celular, vascularização e morfologia, que provavelmente refletem as diferenças encontradas na funcionalidade osteogénica. Em gatos e cavalos, a taxa de proliferação parece ser semelhante em células isoladas da região SCAT e VAT, em gatos e cavalos. No entanto, nos cães verificaram-se diferenças na taxa de proliferação quando se compararam as ADSCs das duas localizações anatómicas de VAT.Em termos de potencial de diferenciação osteogénica, as ADSCs derivadas de VAT demonstraram maior capacidade osteogénica em gatos, particularmente com RA, enquanto que em cavalos as ADSC derivadas do SCAT, particularmente na presença de DEX, apresentaram um potencial superior. No entanto, as ADSCs derivadas de VAT, na presença de RA, exibiram uma capacidade osteogénica aumentada. Curiosamente, nos cães, a análise comparativa entre as duas localizações anatómicas de VAT revelou que as ADSCs derivadas do ligamento falciforme apresentam maior capacidade osteogénica do que as células provenientes do tecido adiposo periovárico, particularmente no programa indutor DEX. Podemos concluir, que foram encontradas características distintas dependendo das localizações anatómicas do tecido adiposo, o que poderá estar na origem das diferenças observadas na funcionalidade das ADSCs. Além disso, os dados revelam a importância da seleção do programa indutor osteogénico mais adequado para cada população celular. Desta forma, o local de colheita do tecido adiposo deve ser tido em consideração para otimizar a funcionalidade osteogénica das ADSCs, bem como para melhorar a eficácia das terapias de regeneração óssea baseadas em ADSCs, adaptandoas especificamente a cada espécie animal.

Triple-negative breast cancer (TNBC), the most aggressive and radioresistant subtype of breast cancer, is associated with a high risk of relapse following radiotherapy (RT). The tumor microenvironment (TME) consists not only of tumor cells but of a different type of cell population populations, including infiltrating immune cells, that are also a target and have influence in the efficacy of RT. TNBC tumors are highly infiltrated with macrophages, that are associated with therapy resistance and a worse prognosis. Therefore, uncovering the macrophage-mediated molecular mechanisms behind TNBC radioresistance will reveal new targets for radiosensitizing therapies and improve disease management. At the same time, understanding the underlying mechanisms and alterations driving tumor cell radioresistance is also essential for developing a more precise and effective treatment strategy. Therefore, our work focuses on the development of experimental models to study radioresistance mechanisms in TNBC. Firstly, as previously reported by our team, we have successfully established 3D in vitro tumor and tumor-immune spheroids, using liquid overlay technique, with TNBC MDA-MB-231 cell line and human macrophages, isolated from healthy donors’ buffy coats. These spheroids were subjected to the RT scheme of 5x5.2 Gy, mimicking a week of patients’ treatment. After 24h of the last irradiation, we unveil that macrophages confer protection from RT to tumor cells. The presence of macrophages not only maintained tumor cell viability, but also increased tumor cell proliferation. To better understand if this effect is cell line dependent, we established tumor spheroids and tumor-immune spheroids with TNBC BT-20 cell line. After 8 days, viability, metabolic activity, morphology, and response to RT were assessed. With this we found that the high proliferation ratio of BT-20 cell line impacts the viability of human macrophages in TIS model, not allowing for the same protective effect than observed in MDA-MB-231 TIS. In parallel, we developed radioresiresistant (RR) cell lines of parental radiosensitive (RS) MDA-MB-231 and Hs578T cell lines. For this, cells received intermittent single doses of irradiation of 2 → 4 Gy, in the first week with a 2-day interval, and weekly single doses of 6 → 8 → 10 → 10 → 10Gy, totalizing a radiation dose of 50Gy irradiated, as previously described in other studies. Then, morphology and colony formation capacity of both RR cell lines was assessed and both RR cell lines have higher colony formation capacities than parental cell lines, at some of these doses. Additionally, migration and invasion capacities of the RR cell lines were assessed. On both a collective and single-cell level, RR cell lines demonstrated an increase in migration capacity. In relation to invasion capacity, while no differences were seen in the Hs578T RR cell line, the MDA-MB-231 RR cell line had an increase in invasion when compared to the parental RS cell line. Lastly, the expression of gelatinases (MMP-2 and MMP-9) revealed no significant difference in MDA-MB-231 RR when compared to the parental RS cell line, indicating that other molecular mechanisms may be involved in the increase of invasion of this cell line. With this thesis, we developed new tools, 3D models and RR cell lines, that allow to better understand the role of macrophages on radioresistance, as well as understand the underlaying mechanisms of radioresistance in TNBC cells. In this way, this work paves the way to identify new therapeutic targets, that in the future may allow for a better survival rate and quality of life for these patients. | O cancro da mama triplo-negativo (CMTN) é o subtipo mais agressivo e radioresistente de cancro da mama e está associado a um maior risco de reincidência após radioterapia (RT). O microambiente tumoral (TME) não é constituído apenas por células tumorais, mas também por outros tipos celulares, incluindo células imunes infiltradas, que também são alvo da ação da RT e influenciam a sua eficácia. O CMTN exibe frequentemente uma alta infiltração de macrófagos que, por sua vez, estão associados a resistência terapêutica e a um pior prognóstico. Assim, a compreensão dos mecanismos pelos quais os macrófagos medeiam resistência à RT, poderá revelar novos alvos terapêuticos, melhorando a resposta dos pacientes ao tratamento. Além disso, é crucial compreender os mecanismos e alterações basais das células tumorais radioresistentes para possibilitar um tratamento mais preciso e eficaz. Assim, o nosso trabalho concentra-se no desenvolvimento de modelos para estudar os mecanismos de radioresistência no CMTN. Primeiramente, como reportado anteriormente pela nossa equipa, estabelecemos modelos 3D in vitro de immuno-esferóides através da técnica de sobreposição líquida, conjugando a linha celular MDA-MB-231 de CMTN com monócitos, isolados de dadores de sangue saudáveis. Estes immuno-esferóides foram submetidos a um esquema de RT de 5x5.2 Gy, mimetizando uma semana de tratamento dos pacientes com CMTN. Após 24h depois da última irradiação, conseguimos revelar que os macrófagos conferem um efeito protetor da RT às células tumorais. A presença de macrófagos, não só manteve a viabilidade celular das células tumorais, como aumentou a proliferação das mesmas. Para compreender se este efeito é dependente da linha celular utilizada, desenvolvemos e caracterizamos immuno-esferóides com outra linha celular de CMTN, nomeadamente, a linha celular BT-20. Após 8 dias de cultura celular, a viabilidade, morfologia, atividade metabólica e resposta à RT foram avaliadas. Assim, percebemos que o elevado rácio de proliferação celular das células BT-20 afeta a infiltração e viabilidade dos macrófagos no modelo de esferóide, e que o efeito protetor à RT anteriormente reportado não se verifica nestes immuno-esferóides. Em paralelo, devolvemos linhas celulares radioresistentes (RR) a partir de linhas celulares parentais radiossensíveis (RS) MDA-MB-231 e Hs578T, administrando doses únicas de irradiação de 2 → 4 Gy, durante a primeira semana e com um intervalo de 2 dias, e doses únicas semanais de irradiação de 6 → 8 → 10 → 10 → 10Gy, até um total de 50 Gy, como previamente descrito na literatura. Para validar a aquisição de radioresistência, a morfologia e a capacidade de formação de colónias de ambas as linhas celulares foram avaliadas e ambas as linhas celulares RR demostraram capacidade superior na formação de colónias, em algumas das doses de irradiação, quando comparadas com as linhas parentais. Adicionalmente, a capacidade de migração e de invasão das linhas celulares estabelecidas, foram avaliadas. As linhas RR mostraram um aumento em ambos os tipos de migração, tanto coletiva como unicelular. Relativamente à invasão, as células MDA-MB-231 RR são mais invasivas do que as suas parentais, enquanto as HS578T RR mostraram a mesma capacidade invasiva quando comparadas com as parentais. Por último, a expressão de gelatinases, nomeadamente da matriz metaloproteinase 2 e 9 (MMP-2 e MMP-9) nas diferentes linhas foi avaliada, mas não foram encontradas diferenças na expressão, sugerindo a existência de outros mecanismos associados ao aumento da capacidade invasiva das MDA-MB-231 RR. Assim, esta tese possibilitou o desenvolvimento de novas ferramentas experimentais para aprofundar a compreensão do papel dos macrófagos na aquisição de radioresistência, bem como o papel dos mecanismos intrínsecos de radioresistência das células tumorais de CMTN. Dessa forma, este trabalho abre caminho para a identificação de novos alvos terapêuticos, visando melhorar a qualidade de vida e a sobrevivência dos pacientes. | Mestrado em Biomedicina Molecular